Ученые из Пущино выяснили, как влияет полигистидиновый «хвост» на активность и свойства эндолизина бактериофага Т5
03.04.2019
Ученые из Института теоретической и
экспериментальной биофизики РАН совместно с коллегами из Филиала Института
биоорганической химии РАН и Института приборостроения РАН исследовали, каким
образом влияет на активность и физико-химические свойства рекомбинантных белков
добавление к их первичной структуре «хвостов» из нескольких остатков
аминокислоты гистидина. Результаты своих исследований они изложили в мартовском
выпуске журнала International Journal of Biological Macromolecules.
Добавление полигистидинового «хвоста» к одному из
концов рекомбинантного белка представляет собой одну из наиболее
распространенных генетических модификаций рекомбинантных белков и широко
используется исследователями. Наличие этой модификации позволяет существенно
упростить выделение и очистку целевого белка, зачастую сводя его к
одностадийной хроматографии на сорбенте, содержащей ионы никеля, кобальта или
меди. Целевой белок, обладающий таким «хвостом», удерживается на
металлосодержащем сорбенте, в отличие от всех остальных клеточных белков, не
имеющих такого «хвоста». Затем связавшийся белок смывают с сорбента с помощью
буфера, содержащего имидазол.
Но у исследователей, работающих с подобными белками,
возникает вопрос: не влияет ли такая модификация на структуру и функцию
конкретного белка. К настоящему времени подобных исследований проводилось
крайне мало.
Ученые из Лаборатории ЯМР-исследований биосистем
ИТЭБ РАН проанализировали влияние добавления полигистидинового «хвоста» на
ферментативную активность и структуру хорошо изученного белка эндолизина
бактериофага Т5. Применение этого белка для биотехнологии и медицины
представляется очень перспективным: исследователи уже продемонстрировали его
способность в присутствии антисептиков активно уничтожать болезнетворные
бактерии, и в будущем, вполне вероятно, эндолизин бактериофага Т5 может стать
средством, альтернативным антибиотикам. Поэтому оптимизация условий очистки
такого белка, как и последствия такой оптимизации, несомненно, представляют
большой интерес.
Помимо сугубо практического интереса именно этот
белок привлек внимание ученых в качестве модели еще по нескольким причинам.
«Во-первых, эндолизин является ферментом, и ферментативную активность и
функциональные свойства рекомбинантного белка с гистидиновым «хвостом» можно
измерить и сравнить с достаточной степенью достоверности с свойствами белка без
“хвоста”. Во-вторых, это небольшой белок (его длина 137 аминокислотных
остатков), структура которого в растворе может быть проанализирована с помощью
ЯМР (ядерного магнитного резонанса) высокого разрешения», - рассказал
заведующий Лабораторией ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН, доктор
физико-математических наук Виктор Павлович Кутышенко. Кроме того, интересным
моментом в этом исследовании был тот факт, что активный центр эндолизина бактериофага
Т5 расположен вблизи С-конца полипептидной цепи этого белка, где ученые
расположили и полигистидиновый «хвост». Не повлияет ли подобное близкое
соседство «хвоста» и активного центра на сворачивание полипептидной цепи?
Оказалось, что сам по себе гистидиновый «хвост» не
оказывает значительного влияния ни на активность, ни на фолдинг белка. Не
меняется и связывание ионов цинка и кальция с белком. Тем не менее ученые
выяснили, что эндолизин с гистидиновым «хвостом» хранится без потери
ферментативной активности меньше, чем фермент без «хвоста». Как предполагают
исследователи, это связано с тем, что рекомбинантный белок, несущий
полигистидиновый «хвост», склонен к самоассоциации. Также оказалось, что
изменилась термостабильность белка: она снизилась на 100С. Помимо всего
вышесказанного, негативное влияние на активность фермента оказывает присутствие
имидазола и ионов никеля, которые появляются в белковом растворе во время
хроматографической очистки. Активность белка может быть восстановлена путем
тщательного вымывания этих низкомолекулярных примесей с помощью длительного
диализа целевого белка в специально подобранных условиях.
Авторы работы отмечают, что данные, полученные для
конкретного белка - эндолизина бактериофага Т5, нельзя догматически проецировать
на другие белки. Тем не менее, их выводы помогут исследователям, планирующим
работу с рекомбинантными белками, выбрать правильную стратегию для выполнения
своих задач.
Источник: Victor P.Kutyshenko, Galina V.Mikoulinskaia, Sergei V.Chernyshov,
Alexander Y.Yegorov, Dmitry A.Prokhorov,Vladimir N.Uversky. Effect of
C-terminal His-tag and purification routine on the activity and structure of
the metalloenzyme, L-alanyl-D-glutamate peptidase of the bacteriophage T5. International
Journal of Biological Macromolecules, Volume 124, 1 March 2019, Pages 810-818
https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S014181301835219X?token=663CC4B665463A7AE6596BE3CD90E6033BDB6E29A68F31DC08741AFEA0A422C2AFC14E99D684AB14EE5DF95418754AE3
Материал подготовила:
Татьяна Перевязова
Пресс-служба ИТЭБ РАН: iteb-press@yandex.ru
Пресс-релизы ИТЭБ РАН:http://web.iteb.psn.ru/press-release.htm